近年来，深度学习方法如 RFdiffusion1（RFD1）和 RFdiffusion2（RFD2）显著推动了蛋白质设计的进展，能够直接生成蛋白质单体、复合物以及结合蛋白。然而，这些方法大多仍局限于“氨基酸残基”级别的表示，难以精确处理小分子、核酸（如 DNA）等非蛋白成分的相互作用。
针对这一瓶颈，Baker 团队提出了关键解决方案：构建一个真正的“全原子”模型。RFdiffusion3（RFD3）在此基础上应运而生。该模型基于扩散模型（diffusion model），直接处理包括主链和侧链在内的所有原子，并支持蛋白质与小分子、核酸的协同生成。其参数量仅为1.68亿（比AlphaFold3的扩散模块减少一半），计算成本却大幅降低至原来RFdiffusion的十分之一。
论文一经发布，立刻在科研社区引发热烈反响。第一作者 Jasper Butcher 在社交媒体上表示：“通过团队协作，我们成功构建了一个能够设计任意生物分子相互作用的统一模型！”另一位作者 Rohith Krishna 也发文称：“RFD3 已在实验室中开启全新的设计方向，代码即将开源！”
🌟 RFdiffusion3 是什么？
与前代方法 RFdiffusion1/2 主要局限于“氨基酸残基”层面的扩散不同，RFD3 实现了更精细的全原子尺度扩散。它不仅能够同时建模蛋白质的主链和侧链原子，还能与 DNA、RNA、小分子等非蛋白组分协同生成，实现对复合物结构的精确设计。
也就是说，RFD3 让研究人员能够在原子级别上灵活“组装”生物大分子，像搭积木一样精确构建蛋白质与其他功能分子之间的相互作用界面。
🔑RFD3 的核心架构
RFD3 的核心架构围绕“原子级扩散”与“多模态条件化”两大突破展开。该模型基于专门为生物分子建模设计的 AtomWorks 框架，将每个氨基酸表示为4个主链原子和最多10个侧链原子（对小侧链使用虚拟原子填充以保证统一表示）。其主干是一个基于 Transformer 的 U-Net 结构，主要分为三个部分：
稀疏 Transformer 模块：通过几何邻近性约束原子间的交互，仅允许空间邻近的原子交换信息，既捕获局部结构又防止过拟合；
下采样模块：负责编码带噪声的原子坐标和残基特征；
上采样模块：利用交叉注意力机制融合原子级别和残基级别的特征，最终预测去噪后的坐标更新。
与 AlphaFold3 不同，RFD3 采用轻量级的 Pairformer（仅2层）来处理条件信息，并省略了计算密集的三角注意力机制，大幅提升了生成速度。
模型支持丰富且灵活的条件控制方式，包括：
原子级约束：可指定催化残基、氢键供体/受体等化学功能，借助分类器引导策略显著提升氢键形成概率（10–23%）；
溶剂暴露程度：控制配体或蛋白界面的埋藏程度；
中心质点约束：指定蛋白质相对于结合靶点的空间质心；
对称性控制：支持生成二聚体、寡聚体等对称组装体；
联合采样：实现蛋白质与 DNA、RNA、小分子等的同步生成与构象优化。
训练策略上，RFD3 采用分层预训练加微调的方法：首先在 PDB 真实复合物结构（数据截至2024年12月）及高质量 AlphaFold2 预测结构上进行预训练，随后针对蛋白–DNA 相互作用及蛋白–蛋白复合物等进行任务特定微调。
RFD3 在计算基准测试（In Silico Benchmarks）中展现出卓越性能，使用 AlphaFold3/Chai 进行评估，涵盖序列-结构一致性（如 RMSD、pTM、PAE 等指标）。
无条件生成：生成的100–250个残基蛋白质显示出高多样性（96个设计中形成41个聚类，TM-score阈值为0.5）；序列组成中丙氨酸占比较高（因模型偏好紧凑折叠）；98%的设计经ProteinMPNN重新序列优化后，AlphaFold3预测的结构与原始设计间RMSD小于1.5 Å。
蛋白-蛋白结合设计：针对5个治疗相关靶点（PD-L1、InsulinR、IL-7Ra、Tie2、IL-2Ra）生成400个设计，支持原子级别“热点”残基指定。RFD3在4/5的靶点上表现优于RFdiffusion1（平均成功聚类数8.2 vs. 1.4，TM-score ≥ 0.6），并生成更多样化的结合界面。
DNA结合蛋白设计：实现了蛋白质与DNA的联合生成（DNA结构仅从序列推断）。针对3个训练集未包含的DNA序列，单体设计成功率8.67%、二聚体为6.67%（DNA对齐RMSD < 5 Å）；不预先固定DNA结构可提高构象多样性。固定界面后使用LigandMPNN优化序列，成功率分别为6.5%和5.5%。
小分子结合蛋白设计：在4种配体（FAD、SAM、IAI、OQO）的基准测试中，RFD3优于RFdiffusionAA，成功标准为蛋白RMSD < 1.5 Å、配体RMSD < 5 Å、最小PAE < 1.5、ipTM > 0.8；联合采样能够生成更新颖、能量更低的复合物结构。
酶活性位点支架化设计：在原子基序酶（AME）基准测试（涵盖41个活性位点）中，RFD3在90%的案例中优于RFD2；对于超过4个残基的“活性岛”，成功率达15%（RFD2为4%）；支持对称性支架设计（所有测试案例均成功生成双亚基活性位点，包括一个7残基岛案例；图3d、S5、S6）。
生成的设计在结构上兼具多样性和新颖性（与PDB现有结构相似度低），经ProteinMPNN重新序列设计后，约70%的设计保留了原有的相互作用界面。
🔥实验验证
RFD3在计算层面的优势成功转化为体外实验验证。研究团队重点针对DNA结合和酶设计两类高难度任务进行了实验测试。
DNA结合蛋白：采用两阶段设计流程：1）针对一段随机DNA序列（CGAGAACATAGTCG，其结构由AF3预测）生成结合蛋白；2）固定关键接触残基，重新采样优化主链构象。合成了5个设计基因，通过酵母表面展示及流式细胞术测量结合亲和力，其中1个设计（DBRFD3）表现出结合活性，EC₅₀ = 5.89 ± 2.15 µM（三次独立实验，四参数logistic拟合）。结构分析表明其通过大沟极性相互作用实现结合。
半胱氨酸水解酶设计：以Ulp-1（PDB: 1EUU）中的最小催化基序（Cys-His-Asp三联体、Gln及底物四面体中间体）为条件，设计用于水解酯底物（4-甲基伞形酮苯乙酸酯）的酶。在筛选的190个设计中，35个显示出多周转催化活性；其中最优设计的Kcat/Km达到3557 M⁻¹s⁻¹，性能超过此前报道的人工酶设计
实验结果表明，RFD3的原子级条件控制显著提高了设计精度；同时，固定关键相互作用残基并未对蛋白质整体折叠产生显著负面影响。
👍结语
论文中指出，其实现基于 AtomWorks 框架（源码位于 GitHub: RosettaCommons/atomworks）。虽然 RFD3 的具体代码库尚未发布，但作者已公开确认 “Code coming soon!”，预示其开源在即。与此同时，在 ModelForge 模型仓库（GitHub: RosettaCommons/modelforge）中，已经整合了与之紧密相关的模型。
RFD3 不只是工具升级，更是蛋白设计范式的转变。它让原子精确功能（如催化、传感）触手可及，适用于治疗（如抗体、酶）和合成生物学。局限？依赖后序列设计，偏紧凑折叠，但未来可端到端整合。Baker 团队又一次证明：AI + 生物 = 无限可能！